酶聯免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以簡單地回答樣本中(zhōng)有多少蛋白(bái)質/多肽/抗體(tǐ)這一(yī)基本問題，是科研中(zhōng)比較常用的一(yī)種檢測方法。而這種簡單的分(fēn)析方法的核心，就是标準曲線。沒有它，我(wǒ)們的實驗就變成了一(yī)個二元的“是/不是”測試。有了它，我(wǒ)們可以深入研究生(shēng)物(wù)反應的細節。那麽，是什麽使得标準曲線如此強大(dà)呢?讓我(wǒ)們在ELISA的背景來讨論這個問題。

簡單地說，标準品就是一(yī)系列已知(zhī)目标蛋白(bái)數量的陽性對照。例如，如果對人類IgG進行ELISA檢測，标準曲線将包含逐漸減少的已知(zhī)量的人類IgG，它會讓你立刻得出一(yī)系列的結論。

是否可以看到标準品的信号？如果可以，實驗是好的；如果沒有，就應該進行故障排除。也許抗體(tǐ)問題，或者系統中(zhōng)的其他東西沒有得到優化。

這是一(yī)個比較棘手的問題。當标準濃度下(xià)降時，信号是否減少？如果答案是肯定的，那就是一(yī)個好的開(kāi)始。如果答案是否定的，可能在某些步驟引入了一(yī)些背景，或者移液管可能需要校準。

一(yī)組适當的标準品總是以空白(bái)結束，在空白(bái)孔中(zhōng)不存在标準品。如果空白(bái)孔OD值爲>0.1，說明可能引入了一(yī)些背景。

 

 

這是我(wǒ)們市場部同事在做實驗培訓時做的“人C反應蛋白(bái)(CRP)酶聯免疫吸附檢測試劑盒（ELK1040）”這個指标的标曲數據（新人已記不清上一(yī)次拿移液器是多少年前）。

 

 

 

用于免疫檢測的所謂“标準曲線"其實稱爲拟合曲線比較合适。免疫檢測時标準點（可以是倍比稀釋的，也可以不是）濃度如果和相應的吸光度（OD）值如果能夠呈現直線關系當然是最理想的了，這時可以通過Excel等方便的獲得拟合曲線，進而推算出樣品的濃度值。但我(wǒ)們做免疫檢測很少有時候能夠有這麽理想的情況，标品濃度和相應OD值往往是"S"型的曲線關系，這時就不能用直線拟合的方式了，而對拟合方法進行選擇就是必要的了。

關于标準曲線的拟合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數、對數等雖都可用于ELISA及其它生(shēng)物(wù)學反應中(zhōng)的曲線拟合，但都隻适用于曲線的一(yī)部分(fēn)，有的适用于前半段，有的适用于後半段，有的适用于中(zhōng)間一(yī)段，而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的适用性。當然，如果用于定量，還是在中(zhōng)間一(yī)段較好。這些方法雖然沒有一(yī)種方法可以通用，但也都可以用。關鍵在于你的标準曲線做到了S形的哪一(yī)部分(fēn)，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一(yī)部分(fēn)。在S曲線的低濃度部分(fēn)可以用乘幂方程很好的拟合，中(zhōng)低濃度部分(fēn)可以用直線方程，中(zhōng)間部分(fēn)可用對數方程，而中(zhōng)後段可用四參數。

目前國際上普遍采用的免疫檢測拟合方式是“四參數邏輯拟合"，用這種拟合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關系，從而進一(yī)步比較正确的獲得樣品中(zhōng)待測物(wù)質的濃度。其實，在一(yī)個長的區間内，Logistic應該都能拟合得較爲理想。但并不是說它就是的。事實上不僅是ELISA，其它很多生(shēng)物(wù)學反應都是S形曲 線，也都可以用Logistic曲線拟合。但建模型是一(yī)回事，而用它來定量是另一(yī)回事。如果用來定量，S形曲線的中(zhōng)間段（較陡處）是比較好的，而兩端的平坦部分(fēn)計算誤差會大(dà)，有時甚至會很大(dà)。

二、做标準曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意

1、樣品的濃度等指标是根據标準曲線計算出來的，所以首先要把做标準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一(yī)件事，否則後面的實驗結果無從談起。

2、設置标準曲線樣品的标準濃度範圍要有一(yī)個比較大(dà)的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在标準曲線濃度範圍之内，包括上限和下(xià)限。而對于呈S型的标準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中(zhōng)間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的範圍内。

3、最好采用倍比稀釋法配制标準曲線中(zhōng)的标準樣品濃度，這樣就能夠保證标準樣品的濃度不會出現較大(dà)的偏離(lí)。

4、檢測标準樣品時，應按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準确性。

5、标準曲線的樣品數一(yī)般爲7個點（除去(qù)零孔、背景孔），但至少要保證有5個點）。

6、做出的标準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動，但一(yī)般來說，相關系數R至少要大(dà)于0.90（至少要有一(yī)個九），對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999。