PCR、qPCR、RT-PCR、Real-time PCR區别淺析-武汉义森科技有限责任公司

技術專欄

PCR、qPCR、RT-PCR、Real-time PCR區别淺析

供稿：技術部

發布時間：2022-07-13

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PCR技術介紹：

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）是在體(tǐ)外(wài)酶促擴增特定DNA片段的技術，由美國Kary Mullis及其同事于1985年發明。熱穩定性Taq DNA聚合酶的應用和自動化裝置的發明與完善，使PCR技術進入實用階段。該技術的發明和廣泛應用，大(dà)大(dà)推動了分(fēn)子生(shēng)物(wù)學各相關學科的發展，發明者也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。

随着PCR技術的成熟，派生(shēng)了不少相關技術。這類技術具有敏感、特異、快速和簡單等優勢，在微生(shēng)物(wù)檢驗中(zhōng)的應用越來越廣，不少國家将其納入檢驗的标準方法；我(wǒ)國檢驗檢疫領域對其應用也日益擴大(dà)，國家要求市級以上疾病預防控制中(zhōng)心具有PCR檢測技術能力，用于突發公共衛生(shēng)事件的快速檢測和食品安全的有效監管等。

PCR技術的基本原理和DNA在體(tǐ)内天然複制過程相似，是在體(tǐ)外(wài)重複進行DNA模闆解鏈、引物(wù)與模闆DNA結合、DNA聚合酶催化形成新DNA鏈的過程，隻是整個過程在體(tǐ)外(wài)進行，而且反應體(tǐ)系比體(tǐ)内更簡單。

1．體(tǐ)系組成和基本過程

（1）體(tǐ)系組成經典PCR以DNA爲模闆，體(tǐ)系組成包括原始模闆、引物(wù)、原料、DNA聚合酶以及合适的鹽、緩沖液以及溫度循環參數等。原始模闆是指長的雙鏈DNA待擴增目的片段，微生(shēng)物(wù)檢驗中(zhōng)往往是待測标本中(zhōng)的DNA。引物(wù)是兩段單鏈寡核苷酸，其序列與待擴增片段的兩端分(fēn)别相同和互補。原料則是4種脫氧核苷三磷酸。

（2）基本過程PCR基本過程分(fēn)爲變性、退火(huǒ)和延伸三個階段，經過多次循環實現目的片段的擴增。變性是指将反應體(tǐ)系混合物(wù)加熱至93℃~95℃，維持較短的時間，一(yī)般30s，使待測的雙鏈DNA在高溫作用下(xià)變性，解鏈爲2條單鏈DNA模闆的過程。退火(huǒ)是指将反應體(tǐ)系混合物(wù)冷卻至特定溫度（也稱退火(huǒ)溫度）。延伸是指将反應體(tǐ)系的溫度提高到72℃，在耐熱DNA聚合酶作用下(xià)，以4種脫氧核苷三磷酸爲原料，按堿基配對原則，合成與兩條模闆DNA互補的2條新的DNA鏈。

2．PCR技術的特點PCR技術顯著的特點，決定了其無論在生(shēng)物(wù)學相關領域的研究，還是在微生(shēng)物(wù)檢驗方面，都具有很重要的地位。

（1）高靈敏度：産物(wù)量以指數方式增加，能将皮克（pg=10-12）量級的起始待測模闆擴增到微克（μg=10-6）水平,能從100萬個細胞中(zhōng)檢出一(yī)個靶細胞等等。

（2）高特異性：以堿基配對原則使引物(wù)與模闆DNA特異正确的結合、DNA聚合酶合成反應具有高度的忠實性、靶基因DNA具有高度特異性和保守性。

（3）方法簡便和快速：一(yī)次性加好反應液，于DNA擴增儀進行變性-退火(huǒ)-延伸，2~4h完成擴增反應；而且擴增産物(wù)易分(fēn)析、無放(fàng)射性污染、易推廣。特别是實時熒光定量PCR的發明和推廣，可以通過電(diàn)腦實時監控反應進程，不需要再對産物(wù)進行檢測，大(dà)大(dà)縮短了實驗時間。

（4）對樣本的純度要求低及适用範圍廣：PCR技術對樣本的純度要求低，DNA粗制品可作爲擴增模闆；不一(yī)定需要分(fēn)離(lí)病毒、細菌或培養細胞；可直接用臨床血液、體(tǐ)腔液、洗漱液、毛發、細胞、活組織等樣本的粗制DNA擴增檢測。适用範圍非常廣泛，不僅适合于微生(shēng)物(wù)的快速檢測，還可用于臨床和法醫等各方面。

PCR的過程大(dà)緻可分(fēn)爲3步：變性—退火(huǒ)—延伸。

變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模闆在熱作用下(xià)，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

退火(huǒ)：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物(wù)與DNA模闆結合，形成局部雙鏈。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下(xià)，以dNTP爲原料，從引物(wù)的3′端開(kāi)始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模闆互補的DNA鏈。

如下(xià)圖所示，在經曆一(yī)次變性退火(huǒ)延伸的流程之後，原本隻有1條的DNA雙鏈變成了2條；2次之後是4條；以此類推，隻要經曆幾十個循環數，就能産生(shēng)大(dà)量的相同DNA片段。

PCR實驗流程示意

MINOR HEAT

後續檢測：

Endless Summer

以上就是常規PCR的正常流程。那在擴增完成之後我(wǒ)們需要對擴增出來的DNA進行檢測，常規的PCR技術通常隻能借助凝膠電(diàn)泳手段。這裏不對電(diàn)泳技術做過多介紹，其是根據DNA的分(fēn)子量大(dà)小(xiǎo)不同對DNA進行分(fēn)離(lí)，從而進行鑒定以及純化DNA的技術。借助凝膠電(diàn)泳可以判斷擴增出來的DNA片段條帶大(dà)小(xiǎo)是否與目的條帶大(dà)小(xiǎo)一(yī)緻，從而知(zhī)道是否得到了想要的産物(wù)；看是否有雜(zá)帶，判斷擴增是否具有特異性；看是否有引物(wù)二聚體(tǐ)判斷引物(wù)的設計好壞等等。

1關于qPCR和Real-time PCR：

很多人誤以爲RT-PCR是Real-time PCR的縮寫，因此将二者混爲一(yī)談，但實際上是不一(yī)樣的。

其實 Real-time-PCR 和 qPCR（Quantitative Rea-time-PCR）是一(yī)碼事，都是實時定量 PCR，指的是PCR 過程中(zhōng)每個循環都有數據的實時記錄，因此可以對起始模闆數量進行精确的分(fēn)析。

雖然 Real-time PCR（實時熒光定量 PCR）和 Reverse transcription PCR（反轉錄PCR）看起來都可以縮寫爲 RT-PCR，但是，國際上的約定俗成的是：RT-PCR 特指反轉錄 PCR，而 Real-time PCR一(yī)般縮寫爲 qPCR（quantitative real-time PCR）。在剛才介紹PCR後續檢測方法的時候，我(wǒ)們說了通常隻能借助凝膠電(diàn)泳去(qù)分(fēn)析産物(wù)，但實時熒光定量PCR借助熒光化學物(wù)質讓我(wǒ)們在PCR的過程當中(zhōng)就可以檢測到DNA的擴增情況，從而不需要再去(qù)跑電(diàn)泳了，極大(dà)的簡化了操作者的實驗步驟。

qPCR的實驗原理：

簡單來講，qPCR就是在整個擴增的過程中(zhōng)，引入了熒光基團，随着DNA數量的成倍增加，反應體(tǐ)系中(zhōng)的熒光信号也會增強。借助對熒光信号的強弱進行檢測，從而對DNA擴增的情況進行定量分(fēn)析。

目前根據不同的熒光物(wù)質，我(wǒ)們可以大(dà)緻将qPCR分(fēn)爲兩種。一(yī)種是用熒光染料，主要爲SYBRGreenⅠ染料，該染料能與DNA雙鏈結合，結合之後會顯示熒光信号，而在沒有結合的時候幾乎檢測不到熒光信号，随着拷貝數的增加，熒光信号增強。而還有一(yī)種是使用熒光探針，又(yòu)叫TaqMan探針法，其原理是根據目的基因設計一(yī)個能與之特異性結合的熒光探針，該探針包含兩個基團：一(yī)個熒光基團和一(yī)個淬滅基團，正常情況下(xià)因爲淬滅基團的存在導緻熒光基團無法發出熒光，而在擴增時探針結合到DNA的模闆上，并且擴增到探針位置時兩個基團被切開(kāi)，從而熒光基團可以發出熒光，同樣随着拷貝數的增加，熒光信号增強。

TaqMan探針法原理圖

借助這種定量關系，人們可以繪制出PCR的擴增曲線，該曲線是熒光信号随着循環數變化而變化的曲線，借助該曲線就可以對PCR的情況進行分(fēn)析，理想的曲線應該是呈現“S”型的增長，但是關于曲線分(fēn)析的内容比較複雜(zá)，在這裏暫時不做過多贅述。至少我(wǒ)們知(zhī)道借助該技術我(wǒ)們可以不用在每次做完PCR之後去(qù)辛苦的跑電(diàn)泳，也可以更精确的分(fēn)析我(wǒ)們的PCR結果。因此該技術被越來越廣泛的應用。

另外(wài)值得一(yī)提的是，在疫情當下(xià)，我(wǒ)們在做完核酸采樣之後到底如何去(qù)判定被檢者的陰性還是陽性，使用的便是qPCR技術，倘若在經過擴增一(yī)定循環數之後能檢測到熒光信号，我(wǒ)們可認爲被檢者爲陽性，反之則陰。

關于RT-PCR：

RT-PCR 就是逆轉錄 PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉錄 PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈式反應（PCR）的一(yī)種廣泛應用的變形。在 RT-PCR 中(zhōng)，一(yī)條 RNA鏈被逆轉錄成爲互補 DNA，再以此爲模闆通過 PCR 進行 DNA 擴增。首先我(wǒ)們要清楚什麽是反轉錄，我(wǒ)們一(yī)般将遺傳信息從DNA流向RNA的過程稱爲轉錄，反之，以RNA爲模闆合成DNA的過程我(wǒ)們稱爲反轉錄。該技術的一(yī)般過程爲，首先以RNA爲模闆在反轉錄酶的作用下(xià)合成其對應cDNA，再以cDNA爲模闆進行普通的PCR過程。歸根結底，其就是在PCR過程前加了一(yī)個反轉錄過程，那在這之後我(wǒ)們既可以用普通PCR手段，也可以采用qPCR進行擴增。比如病毒通常是以RNA爲遺傳物(wù)質，我(wǒ)們在進行病原體(tǐ)檢測的時候隻能提取到它的RNA，所以是需要進行反轉錄的。

其它的PCR技術：

其實除了以上介紹的幾種PCR之外(wài)，現在還有數字PCR技術，也叫核酸分(fēn)子絕對定量技術，相比于熒光定量，該技術更是對DNA數的絕對定量；以及巢式PCR等等。但其本質都離(lí)不開(kāi)最開(kāi)始說的PCR的三個步驟。

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