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常見小(xiǎo)鼠采血方法
小(xiǎo)鼠是科研實驗中(zhōng)常用的實驗動物(wù),但由于其體(tǐ)積小(xiǎo),血管細,采血難度大(dà),進而影響采血的質量。
ELK簡要總結了常見的小(xiǎo)鼠采血方法,僅供參考:
一(yī)隻成年小(xiǎo)鼠的循環血量大(dà)約是1.5~2.5ml,大(dà)約體(tǐ)重的 6~8%。在對營養狀況良好的小(xiǎo)鼠進行采血時,單次采血量最多可以到達循環血量的10%,(例:若20克小(xiǎo)鼠,它的總血量約占1.2-1.4毫升,即每次取120ul-140ul血液不會對小(xiǎo)鼠有太大(dà)的影響)。采血之後應該給予溫熱的等滲溶液補充,可以在2~3個星期内恢複原有的水平。兩周采血量小(xiǎo)于血液循環的10%,單周小(xiǎo)于7.5%,小(xiǎo)鼠血液循環72ml/kg
實驗室常用抗凝劑:乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、枸橼酸鹽、草酸鹽、肝素
實驗室常用采血管:(采血後立即颠倒混勻8次)
1.黑色:枸橼酸鈉;血沉
2.淺藍(lán)色:枸橼酸鈉;血凝試驗(如PT、APTT)
3.深藍(lán)色:肝素鈉或EDTA-Na2;血液微量元素
4.紫色:EDTA-K2;血常規(血液細胞分(fēn)析)
5.綠色:肝素锂;大(dà)部分(fēn)生(shēng)化、血氨
6.灰色:血糖降解抑制劑和EDTA-Na2;血糖
7.棕色:肝素鈉或EDTA-K2;血鉛
8.淺黃色ACD管:葡萄糖、抗凝劑;血庫試驗
9.淺黃色SPS管:SPS液、氯化鈉溶液;血液培養、微生(shēng)物(wù)培養
尾尖采血
麻醉小(xiǎo)鼠後,用溫水(但水溫不要過高)擦拭尾巴,引起輕微的血管擴張。
用無菌手術刀、刀片或鋒利的剪刀,快速截斷小(xiǎo)鼠尾尖0.5-1cm。如果需要多次采血,之後每次僅需截除2-3mm。
可以從尾部向尾尖方向按摩,以增加血流(但是,這會降低血樣的質量,增加溶血的風險)。也可以用毛細采血管收集血液,或直接滴入收集管中(zhōng)。采血結束後,按壓傷口或使用止血劑(如硝酸銀,6%液體(tǐ)火(huǒ)棉膠)來止血。每次采血量大(dà)約可達0.1ml。
眼眶靜脈叢采血
優點:眼眶後靜脈叢采血法方法簡單,便于掌握。血流較快,采血量多,能在較短時間内采約0.5mL血。傷口較小(xiǎo),愈合較快。成功率高,死亡率低。
缺點:不能避免組織液的混入,對于血樣要求較高的研究應謹慎使用。
小(xiǎo)鼠經氣體(tǐ)麻醉後,左手拇指及食指壓迫小(xiǎo)鼠的頸部兩側,阻礙靜脈回流,使眼球充分(fēn)外(wài)突,提示眼眶後靜脈叢充血。也可以将小(xiǎo)鼠放(fàng)置在側卧位,拇指與食指分(fēn)别置于小(xiǎo)鼠頭頂和下(xià)颌,将皮膚向後及向下(xià)拉。抓握時要避免對氣管施壓,否則可能會影響小(xiǎo)鼠呼吸。
将毛細采血管(建議采用0.5*100mm規格的毛細管,在使用前折成小(xiǎo)段,每段大(dà)約3-4cm)置于内側眼角處,并且以與鼻翼平面成30-45度沿内眦插入内眼角,滑入眼球後方,輕輕向眼底方向刺入。
當感到有阻力時即輕輕旋轉采血管的同時施加壓力以切開(kāi)靜脈叢,血液将通過毛細作用流入采血管。不能刺地過深,一(yī)般2-3mm即可。
采血結束後,立即松開(kāi)手指對小(xiǎo)鼠的壓迫,使眼球複位,同時将采血器拔出。可用幹棉球壓住眼眶,确保止血。一(yī)般眼眶靜脈叢采血量可以達到0.2-0.3ml。
颌下(xià)靜脈采血
綁定小(xiǎo)鼠,可将小(xiǎo)鼠側卧,使小(xiǎo)鼠頭部盡量固定。在小(xiǎo)鼠嘴角沿線與外(wài)眼角線橡膠處找到颌下(xià)靜脈的大(dà)緻位置,會發現一(yī)個無毛的小(xiǎo)點,有點像酒窩,基本位于嘴角遠端稍低于下(xià)巴線。
針保持垂直于皮膚表面,刺入皮膚。深度不超過針頭的斜面(約3mm)。拔出針頭後,血液就會流出。爲方便采血,可使小(xiǎo)鼠頭部低于心髒高度。采血結束後,按壓以止血。一(yī)般采血量爲0.2-0.5ml。
隐靜脈采血(總量5%)
将小(xiǎo)鼠置于固定管或架中(zhōng),但保持後腿可自由活動,剃除跗部的毛。爲使膝蓋與踝關節之間的隐靜脈更加明顯,可以在後腿膝蓋以上使用止血帶。在近尾側的皮膚表面可以找到隐靜脈。
針垂直于皮膚表面紮破血管。不要進針過深,以免刺穿肌肉或碰到骨頭。血液會從入針處慢(màn)慢(màn)流出,用毛細采血管收集,并松開(kāi)止血帶。采血結束後,按壓傷口或使用止血劑(如硝酸銀)以止血,并将小(xiǎo)鼠放(fàng)回籠内。
舌下(xià)靜脈采血
将小(xiǎo)鼠麻醉後仰卧于實驗台面上并固定。用眼科彎鑷将小(xiǎo)鼠舌頭拉出,可明顯看到小(xiǎo)鼠舌下(xià)靜脈。
持采血針與舌面呈10°夾角插入舌下(xià)靜脈,見有回血緩慢(màn)抽取,直至采到所需血量。
頸靜脈采血
該方法采血量( 0.2 ml至近全血量) 及采血次數( 1~8次/d) 可随分(fēn)析目的而變動,适用于人手少、動物(wù)數量多、實驗時間緊以及藥代動力學等需連續少量取血的研究中(zhōng)。但要求技術熟練, 方能得心應手。在一(yī)定時間内, 如果采血量和采血次數增加, 會使動物(wù)引起一(yī)定的應激性反應或采血部位的傷害。
将動物(wù)胸前區采血部位皮膚消毒, 于胸前正中(zhōng)線約第四肋骨水平先用注射器針頭沿水平方向刺入皮膚。
再向頸靜脈所在位置沿皮下(xià)進針, 針頭到達頸靜脈所在位置時, 輕引注射器内筒使之呈負壓, 再使注射器與胸部表面成30°~ 40°角向頸靜脈刺入, 此時注射器應與頸靜脈走行方向相一(yī)緻。
在刺入過程中(zhōng), 速度要緩慢(màn), 刺入的深度約5 mm, 在試探性緩慢(màn)刺入或拔出時, 如有血液自動流入注射器内筒, 說明針尖已在頸靜脈内, 此時固定好動物(wù), 勿使注射器針頭移動。
也可将采血針抵在動物(wù)胸骨上以便于操作, 小(xiǎo)心抽引注射器内筒, 待血液足夠時, 拔出采血針, 用幹棉球按壓止血。
尾靜脈采血
一(yī)個人可以用微型手電(diàn)筒或LED小(xiǎo)夜燈等緊貼尾靜脈,在燈光的照射下(xià),尾靜脈會被很清晰的顯示,提高成功率。
固定器(自行設計)小(xiǎo)鼠,将尾巴拉直,用酒精棉球擦拭尾巴或者用熱水或者熱毛巾焐熱尾巴(熱水浸泡鼠尾), 使尾部靜脈擴張。
用左邊手的食指,中(zhōng)指,無名指及大(dà)拇指将小(xiǎo)鼠尾巴固定。
握住1ml 注射器(選用29G的針頭爲宜)前面0.1ml處,右手小(xiǎo)指搭在拽着鼠尾的左手拇指處斜15°角緩慢(màn)進針(鼠尾遠端約1/3的位置)。适當增加内壓看有無回血,若有回血則緩慢(màn)抽取所需血量,棉簽按壓止血。
颌下(xià)靜脈采血
将小(xiǎo)鼠麻醉後,平躺放(fàng)置在實驗台面上,中(zhōng)指、食指固定小(xiǎo)鼠尾部。
用刀片輕劃小(xiǎo)鼠尾側靜脈或尾正中(zhōng)動脈。待血液流出後,用移液槍吸取血液。取血完畢後,棉簽按壓止血。
腹主動脈采血
優點:采血法取血量大(dà)、不易溶血,血液質量較好,适用于多項目檢測,且不損傷器官,有利于病理組織學檢查。
缺點:操作比較複雜(zá),應注意掌握适當的麻醉深度,防止心跳驟停,同時防止大(dà)鼠躁動。本方法造成的出血速度快,易造成出血性的心髒停跳,故要防止采血過程中(zhōng)出血。且本方法采血過程中(zhōng)如多次采血不宜拔出針頭。
将大(dà)鼠腹腔注射麻醉劑後,直到身體(tǐ)全身變軟,把大(dà)鼠仰卧固定在手術台上,背部可以放(fàng)置—粗試管以充分(fēn)暴露腹主動脈。
常規消毒後用手術剪刀沿腹正中(zhōng)線剪開(kāi)腹腔,用小(xiǎo)鑷子輕輕扒開(kāi)血管周圍脂肪,再用棉球把覆蓋在血管的多餘脂肪擦幹淨,直到清晰看清血管爲止(用棉球可以盡量減少小(xiǎo)血管破裂出血,影響接下(xià)來進針時的視線)。
找腹主動脈(粉)在脊柱上面,腹腔靜脈血管(比腹主動脈粗,黑)旁,找到後,術者先固定血管,盡可避免血管移位,左手拇指和食指固定住血管兩旁的脂肪及其它髒器,無名指按住血管進針點的上端,降低血壓,可以避免血液濺出。
右手持穿刺針,針尖斜面朝下(xià),入針角度約(小(xiǎo)于)30度左右,朝向心端方向刺入,深度以5m左右爲宜,進針後可以用止血夾夾住針頭,可以避免麻醉不夠掙紮導緻血管被針頭戳破。
取完血後,用棉球輕壓針眼處,快速拔出針頭,可以反複采集多管的血樣進行不同項目的測試(一(yī)般體(tǐ)重200~300g大(dà)鼠可采血液8~10mL)。
心髒采血(非必需勿用)
優點:取血快,血液不易凝集,心區面積大(dà),進針準确性較高,可一(yī)針見血,且采血量能滿足大(dà)量試驗需要。
缺點:采血成功率較小(xiǎo),死亡率高,心髒損傷較大(dà),難以迅速愈合,不利于短期連續采血,亦無法确定是靜脈血還是動脈血。
一(yī)般有3種心髒采血的姿勢:1、托起小(xiǎo)鼠軀幹使身體(tǐ)垂直與地面。身體(tǐ)直立以防止心髒的偏轉或胸部的扭曲。使用1毫升注射器和22g針頭。将針頭從胸部中(zhōng)央向下(xià)5mm處插入,深度5-10mm,将注射器與胸部保持25-30度;2、使小(xiǎo)鼠仰卧固定,剪去(qù)胸前區被毛,皮膚消毒後,用左手食指在左側第3~4肋間觸摸到心搏處,右手持帶有4~5号針頭的注射器,選擇心搏最強處穿刺;3、使小(xiǎo)鼠側卧,垂直于胸壁插入針頭。
如果血液沒有立刻進入注射器,可以輕輕抽空針管,産生(shēng)一(yī)個真空區。
當注射器中(zhōng)出現血液時,将針管保持靜止并輕輕地抽拉活塞芯杆,以獲得更多的血液。一(yī)般可以采到0.8-1.0ml血液。
摘除眼球采血
用左手拇指、食指和中(zhōng)指抓取小(xiǎo)鼠的頸部頭皮,小(xiǎo)指和無名指固定尾巴,輕壓需要摘取的眼部皮膚,使眼球充血突出。
用眼科剪剪去(qù)小(xiǎo)鼠的胡須,防止血從胡須處順流而下(xià)引起溶血。
用眼科彎鑷夾取眼球并快速摘取,并使血液從眼眶内流入0.5mlEP管中(zhōng)。待小(xiǎo)鼠取血完畢後,斷頸處死。
斷頭采血
用左手拇指和食指以背部較緊的捏住小(xiǎo)鼠頸部皮膚,并作小(xiǎo)鼠頭部朝下(xià)的姿勢。
右手用剪刀猛剪鼠頸,約1/2-4/5的頸部剪斷,讓血滴入容器中(zhōng)。
全血、血漿、血清的區别
全血包括血細胞和血漿的所有成分(fēn)。采集全血時,收集管中(zhōng)必須含有抗凝劑。常用的抗凝劑有:肝素、檸檬酸鈉和乙二胺乙酸酸 (EDTA)。根據不同研究需要進行選擇。
血漿是全血經抗凝處理後,通過離(lí)心沉澱,獲得的不含細胞成分(fēn)的液體(tǐ)。含有纖維蛋白(bái)原、凝血因子等。
血清是全血未經過抗凝處理,血凝塊聚縮釋出的液體(tǐ)。其中(zhōng)沒有纖維蛋白(bái)原和凝血因子。
分(fēn)離(lí)血漿和血清的一(yī)般方法是:2200-2500rpm 離(lí)心至少15分(fēn)鍾。
正常的血清或者血漿樣本爲黃色清液,而若爲偏紅,即爲有紅細胞破裂而産生(shēng)溶血現象。避免溶血應注意以下(xià)的事項:
1.采血時要避免小(xiǎo)鼠毛發、油脂沾染血液導緻溶血,所用的容器、注射器必須清潔幹燥,不能有水或者有機溶劑。
2.抽血時速度不要太快,速度太快會有氣泡産生(shēng)。如果使用止血帶時,止血帶不要紮的太久。
3. 抽出的血放(fàng)入試管時,要先拔掉針頭再放(fàng)血,同時速度不要太快。
4. 收集分(fēn)離(lí)血清的全血時應盡量使血液直接進入小(xiǎo)管底部,避免管壁或管蓋上的血液在離(lí)心過程中(zhōng)導緻溶血
樣本出現溶血還可以用ELISA方法檢測嗎(ma)?
血樣采集操作失誤、強力震蕩和多次凍融都有可能引起溶血發生(shēng)。
在ELISA檢測中(zhōng),若樣本溶血輕微(淺紅色),仍可做ELISA檢測,建議适當增加洗闆次數,減少背景過高影響;若溶血嚴重(深紅色),建議重新取樣。
樣本溶血可能會引起ELISA檢測OD值升高、結果假陽性。
原因可能是樣本中(zhōng)遊離(lí)的血紅蛋白(bái)非特異性吸附在酶标闆上,血紅蛋白(bái)中(zhōng)的亞鐵血紅素具有類似過氧化物(wù)酶的活性,其作用類似于辣根過氧化物(wù)酶,進而催化底物(wù)的反應以增加樣品的OD值并引起假陽性。
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