一(yī)、基本原理

1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶标抗體(tǐ)技術發展成液體(tǐ)标本中(zhōng)微量物(wù)質的測定方法。

這一(yī)方法的基本原理是：①使抗原或抗體(tǐ)結合到某種固相載體(tǐ)表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體(tǐ)與某種酶連接成酶标抗原或抗體(tǐ)，這種酶标抗原或抗體(tǐ)既保留其免疫活性，又(yòu)保留酶的活性。在測定時，把受檢标本（測定其中(zhōng)的抗體(tǐ)或抗原）和酶标抗原或抗體(tǐ)按不同的步驟與固相載體(tǐ)表面的抗原或抗體(tǐ)起反應。用洗滌的方法使固相載體(tǐ)上形成的抗原抗體(tǐ)複合物(wù)與其他物(wù)質分(fēn)開(kāi)，最後結合在固相載體(tǐ)上的酶量與标本中(zhōng)受檢物(wù)質的量成一(yī)定的比例。加入酶反應的底物(wù)後，底物(wù)被酶催化變爲有色産物(wù)，産物(wù)的量與标本中(zhōng)受檢物(wù)質的量直接相關，故可根據顔色反應的深淺進行定性或定量分(fēn)析。由于酶的催化效率很高，故可極大(dà)地放(fàng)大(dà)反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

二、方法類型和操作步驟

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體(tǐ)。在這種測定方法中(zhōng)有3種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體(tǐ)；

②酶标記的抗原或抗體(tǐ)；

③酶作用的底物(wù)；

根據試劑的來源和标本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

（一(yī)）應用親和素和生(shēng)物(wù)素的ELISA

此方法是目前國内主流ELISA試劑盒廠商(shāng)最常用的方法，有廠商(shāng)稱之爲雙抗夾心法，但與真正的“雙抗夾心法”卻有着很大(dà)區别。

親和素是一(yī)種糖蛋白(bái)，可由蛋清中(zhōng)提取。分(fēn)子量60kD，每個分(fēn)子由4個亞基組成，可以和4個生(shēng)物(wù)素分(fēn)子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中(zhōng)提取的鏈黴和素（strepavidin）。生(shēng)物(wù)素（biotin）又(yòu)稱維生(shēng)素H，分(fēn)子量244.31，存在于蛋黃中(zhōng)。用化學方法制成的衍生(shēng)物(wù)，生(shēng)物(wù)素－羟基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白(bái)質、糖類和酶等多種類型的大(dà)小(xiǎo)分(fēn)子形成生(shēng)物(wù)素化的産物(wù)。親和素與生(shēng)物(wù)素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大(dà)，兩者一(yī)經結合就極爲穩定。由于1個親和素分(fēn)子有4個生(shēng)物(wù)素分(fēn)子的結合位置，可以連接更多的生(shēng)物(wù)素化的分(fēn)子，形成一(yī)種類似晶格的複合體(tǐ)。因此把親和素和生(shēng)物(wù)素與ELISA偶聯起來，就能大(dà)幅提高ELISA的信号強度。

親和素－生(shēng)物(wù)素系統在ELISA中(zhōng)的應用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應放(fàng)大(dà)。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體(tǐ)或抗原與生(shēng)物(wù)素結合，通過親和素－生(shēng)物(wù)素反應而使生(shēng)物(wù)素化的抗體(tǐ)或抗原固相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體(tǐ)或抗原量，而且使其結合點充分(fēn)暴露。另外(wài)，在常規ELISA中(zhōng)的酶标抗體(tǐ)也可用生(shēng)物(wù)素化的抗體(tǐ)替代，然後連接親和素-酶結合物(wù)，以放(fàng)大(dà)反應信号。橋聯法ABC-ELISA（avidin biotin complex-ELISA）夾心法測抗原的過程見圖1。

圖1、親和素-生(shēng)物(wù)素系統ELISA

（二）競争法

競争法（圖2-1）可用于測定抗原，也可用于測定抗體(tǐ)。以測定抗原爲例，受檢抗原和酶标抗原競争與固相抗體(tǐ)結合，因此結合于固相的酶标抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下(xià)：

（1）将特異抗體(tǐ)與固相載體(tǐ)連接，形成固相抗體(tǐ)。洗滌。

（2）待測管中(zhōng)加受檢标本和一(yī)定量酶标抗原的混合溶液，使之與固相抗體(tǐ)反應。如受檢标本中(zhōng)無抗原，則酶标抗原能順利地與固相抗體(tǐ)結合。如受檢标本中(zhōng)含有抗原，則與酶标抗原以同樣的機會與固相抗體(tǐ)結合，競争性地占去(qù)了酶标抗原與固相載體(tǐ)結合的機會，使酶标抗原與固相載體(tǐ)的結合量減少。參考管中(zhōng)隻加酶标抗原，保溫後，酶标抗原與固相抗體(tǐ)的結合可達最充分(fēn)的量。洗滌。

（3）加底物(wù)顯色：參考管中(zhōng)由于結合的酶标抗原最多，故顔色最深。參考管顔色深度與待測管顔色深度之差，代表受檢标本抗原的量。待測管顔色越淡，表示标本中(zhōng)抗原含量越多。

圖2-1、競争法測抗原示意圖

（三）雙抗體(tǐ)夾心法

部分(fēn)廠家習慣性把雙抗夾心法做出來的産品稱之爲“一(yī)步法” “減步法” “one step” “quick” 等五花八門的名頭，但其真正操作步驟與雙位點一(yī)步法在操作上有很大(dà)區别。

雙抗體(tǐ)夾心法（圖3）是檢測抗原比較常用的方法，操作步驟如下(xià)：

圖3、雙抗體(tǐ)夾心法測抗原示意圖

（1）将特異性抗體(tǐ)與固相載體(tǐ)連接，形成固相抗體(tǐ)：洗滌除去(qù)未結合的抗體(tǐ)及雜(zá)質。

（2）加受檢樣本：使之與固相抗體(tǐ)接觸反應一(yī)段時間，讓樣本中(zhōng)的抗原與固相載體(tǐ)上的抗體(tǐ)結合，形成固相抗原複合物(wù)。洗滌除去(qù)其他未結合的物(wù)質。

（3）加酶标抗體(tǐ)：使固相免疫複合物(wù)上的抗原與酶标抗體(tǐ)結合。徹底洗滌未結合的酶标抗體(tǐ)。此時固相載體(tǐ)上帶有的酶量與标本中(zhōng)受檢物(wù)質的量正相關。

（4）加底物(wù)：夾心式複合物(wù)中(zhōng)的酶催化底物(wù)成爲有色産物(wù)。根據顔色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，将大(dà)分(fēn)子抗原分(fēn)别制備固相抗原和酶标抗原結合物(wù)，即可用雙抗原夾心法測定标本中(zhōng)的抗體(tǐ)。

（四）雙位點一(yī)步法

在雙抗體(tǐ)夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分(fēn)子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體(tǐ)分(fēn)别作爲固相抗體(tǐ)和酶标抗體(tǐ)，則在測定時可使标本的加入和酶标抗體(tǐ)的加入兩步并作一(yī)步（圖2）。這種雙位點一(yī)步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體(tǐ)，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體(tǐ)的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

圖4、雙位點一(yī)步法示意圖

在一(yī)步法測定中(zhōng)，應注意鈎狀效應（hookeffect），類同于沉澱反應中(zhōng)抗原過剩的後帶現象。當标本中(zhōng)待測抗原濃度相當高時，過量抗原分(fēn)别和固相抗體(tǐ)及酶标抗體(tǐ)結合，而不再形成夾心複合物(wù)，所得結果将低于實際含量。鈎狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

（五）間接法測抗體(tǐ)

間接法（圖5）是檢測抗體(tǐ)最常用的方法，其原理爲利用酶标記的抗抗體(tǐ)以檢測已與固相結合的受檢抗體(tǐ)，故稱爲間接法。操作步驟如下(xià)：

（1）将特異性抗原與固相載體(tǐ)連接，形成固相抗原：洗滌除去(qù)未結合的抗原及雜(zá)質。

（2）加稀釋的受檢血清：其中(zhōng)的特異抗體(tǐ)與抗原結合，形成固相抗原抗體(tǐ)複合物(wù)。經洗滌後，固相載體(tǐ)上隻留下(xià)特異性抗體(tǐ)。其他免疫球蛋白(bái)及血清中(zhōng)的雜(zá)質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中(zhōng)被洗去(qù)。

（3）加酶标抗抗體(tǐ)：與固相複合物(wù)中(zhōng)的抗體(tǐ)結合，從而使該抗體(tǐ)間接地标記上酶。洗滌後，固相載體(tǐ)上的酶量就代表特異性抗體(tǐ)的量。例如欲測人對某種疾病的抗體(tǐ)，可用酶标羊抗人IgG抗體(tǐ)。

（4）加底物(wù)顯色：顔色深度代表标本中(zhōng)受檢抗體(tǐ)的量。

本法隻要更換不同的固相抗原，可以用同一(yī)種酶标抗體(tǐ) 檢測各種與抗原相應的目标待檢抗體(tǐ)。

圖5、間接法測抗體(tǐ)示意圖

（六）捕獲法測IgM抗體(tǐ)

捕獲包被法（亦稱反向間接法）ELISA，首要用于血清中(zhōng)某種抗體(tǐ)亞型成分(fēn)（如 IgM）的測定。以目前常用的 IgM 測定爲例，因血清中(zhōng)針對某種抗原的特異性 IgM 和 IgG 同時存在，而IgG可幹擾 IgM 的測定。因此先将一(yī)切血清 IgM（包括異性 IgM 和非特異性 IgM）固定在固相上，在去(qù)除 IgG 後再測定特異性 IgM。IgM 抗體(tǐ)的檢測用于流行症的前期确診中(zhōng)。先用抗人 IgM 抗體(tǐ)包被固相，以捕獲血清标本中(zhōng)的 IgM（其間包括針對抗原的特異性 IgM 抗體(tǐ)和非特異性的 IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性 IgM 相結合。繼而加酶标記針對抗原的特異性抗體(tǐ)。再與底物(wù)作用，呈色即與标本中(zhōng)的 IgM 成正相關。此法常用于病毒性感染的前期确診。類風濕因子（RF）相同能攪擾捕獲包被法測定 IgM 抗體(tǐ)，導緻假陽性反響。因此中(zhōng)和 IgG 的間接法近來頗受喜愛，用這類試劑檢測抗 CMV IgGM 和抗弓形蟲 IgM 抗體(tǐ)已獲成功。操作步驟如下(xià)：

圖6、捕獲法測IgM抗體(tǐ)示意圖

（1）将抗人IgM抗體(tǐ)連接在固相載體(tǐ)上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清标本：保溫反應後血清中(zhōng)的IgM抗體(tǐ)被固相抗體(tǐ)捕獲。洗滌除去(qù)其他免疫球蛋白(bái)和血清中(zhōng)的雜(zá)質成分(fēn)。

（3）加入特異性抗原試劑：它隻與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶标抗體(tǐ)：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

（5）加底物(wù)顯色：如有顔色顯示，則表示血清标本中(zhōng)的特異性IgM抗體(tǐ)存在，是爲陽性反應。

ELISA的技術要點

ELISA的技術要點包括三個方面：試劑的制備、反應條件的選擇和操作的标準化。

一(yī)、試劑的制備

ELISA的主要試劑爲固相的抗原或抗體(tǐ)、酶标記的抗原或抗體(tǐ)和與标記酶直接關聯的酶反應底物(wù)。以下(xià)叙述這些試劑的原料和制備方法。

（一(yī)）固相載體(tǐ)

可作ELISA中(zhōng)載體(tǐ)的物(wù)質很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白(bái)質的性能，抗體(tǐ)或蛋白(bái)質抗原吸附其上後保留原來的免疫活性。聚苯乙烯爲塑料，可制成各種形式。在ELISA測定過程中(zhōng)，它作爲載體(tǐ)和容器，不參與化學反應。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。ELISA載體(tǐ)的形狀主要有三種：小(xiǎo)試管、小(xiǎo)珠和微量反應闆。小(xiǎo)試管的特點是還能兼作反應的容器，最後放(fàng)入分(fēn)光光度計中(zhōng)比色。小(xiǎo)珠一(yī)般爲直徑0.6cm的圓球，表面經磨砂處理後吸附面積大(dà)增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中(zhōng)使圓珠滾動淋洗，效果更好。最常用的載體(tǐ)爲微量反應闆，專用于ELISA測定的産品也稱爲ELISA闆，國際通用的标準闆形是8×12的96孔式。爲便于作少量标本的檢測，有制成8聯或12聯孔條的，放(fàng)入座架後，大(dà)小(xiǎo)與标準ELISA闆相同。ELISA闆的特點是可以同時進行大(dà)量标本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀器用于微量反應闆型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的标準化極爲有利。良好的ELISA闆應該是吸附性能好，空白(bái)值低，孔底透明度高，各闆之間和同一(yī)闆各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA闆由于配料的不同和制作工(gōng)藝的差别，各種産品的質量差異很大(dà)。因此每一(yī)批号的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法爲：以一(yī)定濃度的人IgG（一(yī)般爲10ng/ml）包被ELISA闆各孔後，每孔内加入适當稀釋的酶标抗人IgG抗人IgG抗體(tǐ)，保溫後洗滌，加底物(wù)顯色，終止酶反應後分(fēn)别測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各讀數在0.8左右。計算所有讀數的平均值。所有單個讀數與平均讀數之差應小(xiǎo)于10％。與聚苯乙烯類似的塑料爲聚氯乙烯。作爲ELISA固相載體(tǐ)，聚氯乙烯闆的特點爲質軟闆薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯闆。聚氯乙烯對蛋白(bái)質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白(bái)值有時也略高。爲比較不同固相在某一(yī)ELISA測定中(zhōng)的優劣，可用以下(xià)方法加以檢驗：用其它免疫學測定方法選出一(yī)個典型的陽性标本和一(yī)個典型的陰性标本。将它們分(fēn)别進行一(yī)系列稀釋後，在不同的固相載體(tǐ)上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然後比較測定結果。在哪一(yī)種載體(tǐ)上陽性結果與陰性結果判别最大(dà)，這種載體(tǐ)就是這一(yī)ELISA測定的最合适的固相載體(tǐ)。除塑料制品外(wài)，固相酶免疫測定的載體(tǐ)還有兩種材料：一(yī)是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式将在“膜載體(tǐ)的酶免疫測定”中(zhōng)介紹。另一(yī)種載體(tǐ)是以含鐵的磁性微粒制作的，反應時固相微粒懸浮在溶液中(zhōng)，具有液相反應的速率，反應結束後用磁鐵吸引作爲分(fēn)離(lí)的手段，洗滌也十分(fēn)方便，但需配備特殊的儀器。