一(yī)、原理：免疫共沉澱（Co-Immunoprecipitation）是以抗體(tǐ)和抗原之間的專一(yī)性作用爲基礎的用于研究蛋白(bái)質相互作用的經典方法。是确定兩種蛋白(bái)質在完整細胞内生(shēng)理性相互作用的有效方法。

其原理是：當細胞在非變性條件下(xià)被裂解時，完整細胞内存在的許多蛋白(bái)質－蛋白(bái)質間的相互作用被保留了下(xià)來。如果用蛋白(bái)質X的抗體(tǐ)免疫沉澱X，那麽與X在體(tǐ)内結合的蛋白(bái)質Y也能沉澱下(xià)來。

目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體(tǐ)反應後，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目标蛋白(bái)質是否在體(tǐ)内結合；也可用于确定一(yī)種特定蛋白(bái)質的新的作用搭檔。

其優點爲：

（1）相互作用的蛋白(bái)質都是經翻譯後修飾的，處于天然狀态；

（2）蛋白(bái)的相互作用是在自然狀态下(xià)進行的，可以避免人爲的影響；

（3）可以分(fēn)離(lí)得到天然狀态的相互作用蛋白(bái)複合物(wù)。

缺點爲：

（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白(bái)質－蛋白(bái)質相互作用；

（2）兩種蛋白(bái)質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中(zhōng)間起橋梁作用；

（3）必須在實驗前預測目的蛋白(bái)是什麽，以選擇最後檢測的抗體(tǐ)，所以，若預測不正确，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。

二、準備工(gōng)作：

預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好後，埋冰下(xià)），離(lí)心機

1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最後一(yī)次吸幹PBS；

2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)

3. 用預冷的細胞刮子将細胞從培養皿或培養瓶上刮下(xià)，把懸液轉到1.5EP管中(zhōng)，4℃，緩慢(màn)晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上）

4. 4℃，14000g離(lí)心15min，立即将上清液轉移到一(yī)個新的離(lí)心管中(zhōng)

5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然後用PBS配制成50%濃度，建議剪掉移液器吸頭，尖頭部分(fēn)，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中(zhōng)破壞瓊脂糖珠

6. 每1ml總蛋白(bái)中(zhōng)加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去(qù)除非特異性雜(zá)蛋白(bái)，降低背景

7. 4℃，14000g離(lí)心15min，将上清轉移到一(yī)個新的離(lí)心管中(zhōng)，去(qù)除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白(bái)标準曲線，測定蛋白(bái)濃度，測前将總蛋白(bái)至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中(zhōng)去(qù)垢劑的影響（定量，分(fēn)裝後，可以在-20℃保存一(yī)個月）

9. 用PBS将總蛋白(bái)稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中(zhōng)去(qù)垢劑的濃度，如果誘餌蛋白(bái)在細胞中(zhōng)含量較低，則總蛋白(bái)濃度應該稍高（如10 μg/μl）

10. 加入一(yī)定體(tǐ)積的兔抗到500μl總蛋白(bái)中(zhōng)，抗體(tǐ)的稀釋比例因誘餌蛋白(bái)在不同細胞系中(zhōng)的多少而異

11. 4℃緩慢(màn)搖動抗原抗體(tǐ)混合物(wù)過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分(fēn)析建議用2 h室溫孵育

12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體(tǐ)複合物(wù)，4℃緩慢(màn)搖動抗原抗體(tǐ)混合物(wù)過夜或室溫1h，如果所用抗體(tǐ)爲鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體(tǐ)"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）

13. 14000rpm瞬時離(lí)心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體(tǐ)複合物(wù)，去(qù)上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體(tǐ)複合物(wù)内部的結合，可以使用PBS

14. 用60μl 2×上樣緩沖液将瓊脂糖珠-抗原抗體(tǐ)複合物(wù)懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）

15. 将上樣樣品煮5min，以遊離(lí)抗原，抗體(tǐ)，珠子，離(lí)心，将上清電(diàn)泳，收集剩餘瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以後電(diàn)泳，電(diàn)泳前應再次煮5min變性。

RIPA Buffer配制：

RIPA蛋白(bái)酶抑制劑

工(gōng)作液配制：

配制100ml的modified RIPA buffe：

1. 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去(qù)離(lí)子水中(zhōng)，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調節PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去(qù)氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

5. 理論上，蛋白(bái)酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入（抑蛋白(bái)酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白(bái)酶抑制劑各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中(zhōng)很不穩定，30分(fēn)鍾就會降解一(yī)半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分(fēn)可以在水溶液中(zhōng)穩定5天。

RIPA蛋白(bái)酶抑制劑各種成分(fēn)在工(gōng)作液中(zhōng)的終濃度：

三、實驗流程爲：

（1）轉染後24-48 h 可收獲細胞，加入适量細胞裂解緩沖液（含蛋白(bái)酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C，最大(dà)轉速離(lí)心30 min後取上清；

（2）取少量裂解液以備Western blot分(fēn)析，剩餘裂解液加1μg相應的抗體(tǐ)加入到細胞裂解液，4°C緩慢(màn)搖晃孵育過夜；

（3）取10μl protein A 瓊脂糖珠，用适量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離(lí)心3 min；

（4）将預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體(tǐ)孵育過夜的細胞裂解液中(zhōng)4°C緩慢(màn)搖晃孵育2-4h，使抗體(tǐ)與protein A瓊脂糖珠偶連；

（5）免疫沉澱反應後，在4°C 以3,000 rpm 速度離(lí)心3 min，将瓊脂糖珠離(lí)心至管底；将上清小(xiǎo)心吸去(qù)，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最後加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分(fēn)鍾；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分(fēn)析。通過免疫共沉澱确定結合蛋白(bái)

1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養闆上的适宜細胞。刮去(qù)每塊闆上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中(zhōng)。

2．将每毫升細胞懸液轉移到微量離(lí)心管中(zhōng)，在微量離(lí)心機上4℃以最大(dà)速度離(lí)心15 min。

3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的适當抗體(tǐ)，4℃搖動免疫沉澱物(wù)1 h。

4．加入0.9 ml的蛋白(bái)質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉澱物(wù)30 min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白(bái)A-Sepharose混合物(wù)，再重複洗5次。最後，用NETN洗一(yī)次。

6．吸出混合物(wù)的液體(tǐ)部分(fēn)。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中(zhōng)，煮沸4 min。

7．将樣品加入到大(dà)孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中(zhōng)，在10 mA的恒定電(diàn)流下(xià)電(diàn)泳過夜。

8．通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白(bái)質泳帶。

9．從膠上切下(xià)目标帶，将其放(fàng)到微量離(lí)心管中(zhōng)，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。

10． 用胰蛋白(bái)酶消化膠中(zhōng)的蛋白(bái)質，再将肽電(diàn)洗脫。

11． 通過窄孔高效液相色譜分(fēn)離(lí)肽。将收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。

四、注意的問題：

（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞内存在的所有蛋白(bái)質－蛋白(bái)質相互作用，多采用非離(lí)子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一(yī)樣的，通過經驗确定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中(zhōng)要加各種酶抑制劑，如商(shāng)品化的 cocktailer。

（2）使用明确的抗體(tǐ)，可以将幾種抗體(tǐ)共同使用

（3）使用對照抗體(tǐ)：

單克隆抗體(tǐ)：正常小(xiǎo)鼠的IgG或另一(yī)類單抗

兔多克隆抗體(tǐ)：正常兔IgG

在免疫共沉澱實驗中(zhōng)要保證實驗結果的真實性，應注意以下(xià)幾點：

(1) 确保共沉澱的蛋白(bái)是由所加入的抗體(tǐ)沉澱得到的，而并非外(wài)源非特異蛋白(bái)，單克隆抗體(tǐ)的使用有助于避免污染的發生(shēng)；

(2) 要确保抗體(tǐ)的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物(wù)中(zhōng)添加抗體(tǐ)後不會引起共沉澱；

(3) 确定蛋白(bái)間的相互作用是發生(shēng)在細胞中(zhōng)，而不是由于細胞的溶解才發生(shēng)的，這需要進行蛋白(bái)質的定位來确定。

關于CoIP 的對照組怎麽設置，可以在Openi 這個網站中(zhōng)直接搜索「CoIP」論文裏的圖片，看看前輩們怎麽做的就知(zhī)道該如何設置對照了

接下(xià)來就按照實驗既定流程走就行了，最後實驗結果我(wǒ)們用幾篇文章的結果來舉例：

有了這樣的結果，文章檔次一(yī)下(xià)子就上去(qù)了。