ELK Biotechnology總結Elisa實驗中(zhōng)細胞樣本的制備與保存-武汉义森科技有限责任公司

技術專欄

ELK Biotechnology總結Elisa實驗中(zhōng)細胞樣本的制備與保存

供稿：市場部

發布時間：2022-12-13

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細胞培養上清

　　①将細胞培養上清液吸入離(lí)心管中(zhōng)，在2-8℃下(xià)以1000×g離(lí)心20分(fēn)鍾，除去(qù)細胞碎片和雜(zá)質，收集上清液備用，

　　②樣本保存在-20℃或-80℃，避免反複凍融。

01 uniprot

Q:那什麽情況下(xià)需要測細胞裂解液，什麽情況下(xià)是檢測細胞培養液上清呢？

A:首先從細胞培養的形态（貼壁細胞、懸浮細胞）所檢測蛋白(bái)分(fēn)泌表達位置：

在uniprot蛋白(bái)數據庫中(zhōng)Subcellular Location 欄目可查到該蛋白(bái)的分(fēn)泌表達部位

例1：mouse 白(bái)介素6的分(fēn)泌表達位置，細胞質，質膜，胞外(wài)表達。

一(yī)、勻漿介質（量）

一(yī)般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據樣本及測定指标的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環境。

二、細胞樣本的前處理:

1、細胞沉澱的收集：

①懸浮細胞:對于懸浮培養的細胞，直接通過離(lí)心收集細胞沉澱，将培養液在室溫條件下(xià)1000轉/分(fēn),離(lí)心10分(fēn)鍾，棄上清留細胞沉澱。

②貼壁細胞:對于貼壁培養的細胞，用胰酶将細胞消化下(xià)來，或用細胞刮将細胞刮下(xià)來，将培養液在室溫條件下(xià)1000轉/分(fēn),離(lí)心10分(fēn)鍾，棄上清留細胞沉澱。

我(wǒ)們一(yī)般建議客戶，細胞密度不要小(xiǎo)于10⁶個/ml。

2、細胞沉澱的洗滌：

在細胞沉澱中(zhōng)加入0.5-1ml的PBS（等滲），輕輕颠倒混勻，将培養液在室溫條件下(xià)1000轉/分(fēn),離(lí)心10分(fēn)鍾，棄上清留細胞沉澱。重複上述操作反複洗滌1～2次。

三、勻漿的方式：

手工(gōng)勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反複凍融。

①手工(gōng)勻漿：在細胞沉澱中(zhōng)加入一(yī)定量的PBS（PBS的加入量根據所測指标的不同而有所改變，一(yī)般加入0.5ml，細胞密度不小(xiǎo)于一(yī)百萬個/ml），混勻，将細胞懸浮于PBS中(zhōng)，用移液器将細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(zhōng)（2ml玻璃勻漿管），将玻璃勻漿管置于冰水混合物(wù)中(zhōng)，手動勻漿3分(fēn)鍾，然後取破碎好的細胞懸浮液進行測定。

②超聲破碎:

在細胞沉澱中(zhōng)加入一(yī)定量的PBS（PBS的加入量根據所測指标的不同而有所改變，一(yī)般加入0.5ml，細胞密度不小(xiǎo)于一(yī)百萬個/ml），混勻，将細胞懸浮于PBS中(zhōng)，在冰水浴條件下(xià)進行如下(xià)操作:

a、用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發生(shēng)器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國産超聲波發生(shēng)儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反複3～5次。

b、用超聲細胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重複4～5次。

③裂解液裂解

常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去(qù)垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強弱不同。

1、SDS屬于離(lí)子型去(qù)垢劑，效果最強，基本可以把細胞核膜破壞掉，DNA會釋放(fàng)出來，裂解液變得很粘稠。

2、NP-40是很溫和的去(qù)垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白(bái)。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分(fēn)之一(yī)，在保護蛋白(bái)活性方面有一(yī)定作用（SDS基本會使蛋白(bái)變性失活）。

去(qù)垢劑屬性隻是一(yī)方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白(bái)變性劑,對酶活力的測定有一(yī)定的影響,一(yī)般不推薦用裂解液進行裂解。

④反複凍融:

在細胞沉澱中(zhōng)加入一(yī)定量的PBS（PBS的加入量根據所測指标的不同而有所改變，一(yī)般加入0.5ml，細胞密度不小(xiǎo)于一(yī)百萬個/ml），混勻，将細胞懸浮于PBS中(zhōng)，放(fàng)低溫冰箱中(zhōng)結冰，溶解，再結冰，再溶解，反複3次左右）。由于反複凍融對酶活力影響較大(dà)，一(yī)般使用生(shēng)化法測酶活時不能使用。